Резистентные мутации вируса гепатита В у энтекавир-рефрактерных пациентов

Описание: Новости о медицине, препараты, отзывы о компаниях

Administrator 2
Автор темы, Администратор
Администратор
Administrator 2
Автор темы, Администратор
Администратор
Репутация: 0 (+0/−0)
Лояльность: 3 (+3/−0)
Сообщения: 224
Зарегистрирован: 17.04.2017
С нами: 7 месяцев 7 дней

#1 Administrator 2 » 06.05.2017, 19:37

Абстрактные

Появление резистентных мутаций в гене обратной транскриптазы вируса гепатита B (HBV) связано с неудачей лечения. Энтекавир (ETV) является одним из наиболее эффективных анти-HBV реагентов; Он имеет очень низкую частоту резистентности и используется в качестве терапии первой линии при хроническом гепатите B. В этом исследовании мы выделили HBV у 4 пациентов с резистентностью к ETV (2 с вирусным прорывом, 1 с частичным вирусологическим ответом и 1 с вспышкой -up) и оценивали резистентность к ETV с использованием репликационно-компетентных молекулярных клонов длиной генома HBV в 1,38 раза. Определены полные последовательности генома инфицированных HBV у невосприимчивых к ETV пациентов. Молекулярные клоны HBV были получены с последовательностями, полученными от пациентов. После трансфекции этих молекулярных клонов в клетки HepG2 репликации вируса и восприимчивость к ETV оценивали путем измерения количества ДНК HBV, связанной с внутриклеточными ядрами и частицами, с использованием Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Среди этих случаев были обнаружены устойчивые к ETV варианты у 2 пациентов с вирусным прорывом, и в этих вариантах были успешно идентифицированы ответственные аминокислотные мутации в обратной транскриптазе. В остальных случаях не обнаружена устойчивая к ETV мутация. Выявленные ETV-устойчивые мутации не давали резистентности к фумарату тенофовира дизопроксила. Заключение: модель репликации HBV с последовательностями, полученными от пациентов, полезна для оценки эффективности репликации, восприимчивости к анти-HBV-реагентам и мутаций резистентной резистентности и может помочь в выборе подходящей стратегии лечения случаев хронического гепатита B. (Гепатология Communications 2017, 1: 110-121)

Сокращения:

CI
доверительный интервал
EC50
Эффективные концентрации, необходимые для ингибирования 50%
ETV
энтекавира
HBeAg
Антиген гепатита В
HBsAg
Поверхностный антиген гепатита В
HBV
Вирус гепатита В
HCC
Гепатоцеллюлярная карцинома
HLA
Человеческий лейкоцитарный антиген
LAM
ламивудин
Не Доступно
Аналог нуклеоса (t)
ПЦР
полимеразной цепной реакции
RT
Обратная транскриптаза
TDF
Тенофовир дизопроксил фумарат
VBT
Вирусный прорыв

Введение

Вирус гепатита В (HBV), входящий в семейство Hepadnaviridae, имеет частично двухцепочечный геном ДНК 3,2 кб и содержит четыре открытые рамки считывания, кодирующие поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), антиген ядра / гепатита В (HBeAg ), Вирусной полимеразы и белка X. [1, 2] Инфекция этим вирусом вызывает тяжелые заболевания печени, включая острый, хронический и фульминантный гепатит; цирроз печени; И гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) [3]. Хотя эффективные вакцины против гепатита В доступны во многих странах, хроническая гепатит B (CHB) остается серьезной проблемой глобального здравоохранения. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, около 240 миллионов человек страдают от инфекций ХГБ, и эти люди подвержены риску развития цирроза и ГЦР [4, 5]. В настоящее время клинически доступны два класса реагентов против HBV: интерферон-α и нуклеосомы (T) идеологов (NA). Лечение интерфероном может снизить HBeAg и HBsAg путем сочетания прямого противовирусного и иммуномодулирующего эффектов [6], но оно связано с неблагоприятными побочными эффектами. NAs нацеливают на стадию обратной транскрипции и ингибируют продуцирование ДНК HBV из прегеномной РНК. Хотя эти реагенты улучшают заболевания печени и предотвращают прогрессирование заболевания до HCC, такое длительное лечение часто вызывает появление резистентных мутаций. В Японии одобрены NAs ламивудина (LAM), адефовира дипивоксила (ADV), энтекавира (ETV) и тенофовира дизопроксилфумарата (TDF). Поскольку эти NAs имеют общую мишень для вирусной обратной транскриптазы (RT), мутации резистентности к этим реагентам были зарегистрированы только в RT-доменах. Среди этих NAs ETV является одним из самых мощных реагентов против HBV; Он имеет очень низкий уровень резистентности у пациентов, не получавших лечение [7-11], и уже давно используется в качестве реагента первой линии. На сегодняшний день зарегистрировано ограниченное количество устойчивых к ETV мутаций. Они включают мутанты LAM-устойчивых ассоциированных аминокислот при rt180 и rt204 и требуют дополнительных мутаций у rt169, rt184, rt202 или rt250. [8, 12] Сообщалось о мутациях rtI163V и rtA186T в дополнение к LAM-устойчивым мутациям Для придания сопротивлению ETV. [13]
В этом исследовании мы выделили HBV из четырех случаев с рефрактерностью к ETV (2 пациента с вирусным прорывом [VBT], 1 пациент с частичным вирусологическим ответом и 1 с обострением) и генерировали репликации компетентные 1,38-кратные молекулярные клоны HBV с длиной генома с Полученных из пациента последовательностей. После трансфекции этих молекулярных клонов в клетки HepG2 репликации вируса и восприимчивость к ETV оценивали путем измерения количества внутриклеточной ДНК HBV, связанной с частицами ядра, с использованием Саузерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР).

Материалы и методы

ПАЦИЕНТЫ

Мы провели ретроспективный анализ 70 пациентов с ХГБ (мужчина / женщина, 53/17, средний возраст 46,6 ± 8,9 года), которые получали лечение ЭТВ в больнице Сейзанкай Киёкава, Токио, Япония, с декабря 2006 года по май 2016 года. Все пациенты были Клинически диагностировали с хроническим гепатитом и были HBsAg-позитивными и HBV ДНК-положительными в течение по крайней мере 6 месяцев до начала лечения. Ни у кого не было выявлено цирроза или ГЦК. Все пациенты получали 0,5 мг ETV более 1 года, и ни один пациент не получал другие NA. Это исследование было одобрено комитетами по этике наших учреждений (номер утверждения 246 из больницы Сейзанкай Кийокава и 377 из Национального института инфекционных болезней), и получено письменное информированное согласие от каждого пациента. Из 70 пациентов с ХГБ, получавших ЭТВ, четыре случая оказались резистентными (табл. 1). Эти четыре субъекта были мужчинами, положительными на HBsAg и HBeAg, и заразились генотипом C. HBV. Их возраст колебался от 40 до 59 лет, и все они были отрицательными по серологическим маркерам вируса гепатита C и вирусным инфекциям человека. Профили 4 рефрактерных пациентов с ЭТВ следующие: Случай А (мужчина 40 лет, рисунок 1А): Введение ETV (0,5 мг в день) было начато в августе 2007 г. ДНК сывороточного HBV стала необнаруживаемой через 3 года Лечения ЭТВ, но вновь возник после 3,3 лет лечения. В то время титр ДНК HBV составлял 8,0 log копий / мл. Увеличенная дозировка ETV (1,0 мг в день) не была эффективной. Этот случай был диагностирован как случай VBT. HBV выделяли из образцов сыворотки, собранных в два момента времени, в начале лечения (момент времени 1) и в VBT (момент времени 2) (фиг.1A). Выделенные HBV были названы клонами A1 и A2, соответственно. Все геномы выделенных HBV секвенировали и выведенные аминокислоты в области RT были выровнены и сравнивались с консенсусной последовательностью генотипа C (поддерживающая фигура S1). Известная мутация резистентности к NA не была обнаружена в клоне A1. Однако сообщаемые LAM-устойчивые мутации rtV173L / L180M / M204V появились в клоне A2. Случай B (43-летний мужчина, рисунок 1B): введение ETV (0,5 мг ежедневно) было начато в апреле 2007 года. ДНК сывороточного HBV не определялась после 2,5 лет лечения ETV и оставалась необнаруживаемой до 6,8 лет с начала ETV, когда ДНК HBV вновь появилась и достигла 8.3 log копий / мл. Этот случай был также диагностирован как случай VBT. HBV, выделенные в начале лечения (момент времени 1) и в VBT (момент времени 2), были секвенированы (фиг.1B). Как и в случае HBV, выделенных в случае A, мутация резистентности не обнаружена в клоне B1. Однако мутации rtN238H / L269I, сопровождающиеся LAM-устойчивыми мутациями rtL180Q / M204V, появились в клоне B2. Случай C (59-летний мужчина, рисунок 1C): Администрация ETV (0,5 мг ежедневно) была запущена в июне 2010 года. ДНК сывороточного HBV была 9,1 log копий / мл до лечения и вскоре уменьшилась до 5,0 log копий / мл После запуска ETV; Однако ДНК HBV оставалась положительной в течение 1,5 лет лечения ЭТВ. Этот случай рассматривался как частичный случай вирусологического ответа. HBV, выделенный из образцов сыворотки в нескольких временных точках (временные точки 1-3 на фиг.1C), секвенировали. Из этих клонов HBV выведенные аминокислотные последовательности в RT-области были идентичными, но имели несколько различий по сравнению с консенсусной последовательностью генотипа C. Случай D (53-летний мужчина, рисунок 1D): Администрация ETV (0,5 мг ежедневно) была запущена в июне 2007 года. После 2 лет лечения ETV ДНК HBV сыворотки стала необнаруживаемой. Через 3 года после начала лечения ETV ДНК HBV внезапно вспыхнула. Это обострение ДНК HBV было кратковременным и уменьшалось до неопределяемого уровня без дополнительного лечения. Поэтому этот случай был определен как случай вспышки. HBV выделяли в трех временных точках: начало лечения (момент времени 1), точка вспышки (точка времени 2) и точка спада (момент времени 3) (рис. 1D). Выведенные аминокислотные последовательности в RT-области были идентичными в клонах D1 и D3 и аминокислотная замена V191I была обнаружена в клоне D2. Все четыре пациента были наивными и подтвердили свою приверженность лечению.

IMG_0653.PNG

Рисунок 1.

Клинические курсы для 4 пациентов с резистентностью к ETV (A: случай A с VBT, B: случай B с VBT, C: случай C с частичным вирусологическим ответом, D: случай D с обострением). Указываются титры ДНК HBV сыворотки (сплошные квадраты) и уровни ALT (открытые круги). Нижний предел обнаружения ДНК HBV обозначен пунктирной линией. Образцы сыворотки собирали в моменты времени, обозначенные открытыми стрелками с числами, и анализировали последовательности зараженного HBV. Аббревиатура: ALT, аланинаминотрансфераза.



ВИРУСНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ВГВ

HBsAg и HBeAg измеряли с помощью хемилюминесцентного иммуноанализа с использованием набора для коммерческого анализа (Abbott Japan Co., Ltd., Токио, Япония). Генотип HBV определяли с помощью иммуноферментного анализа (IMMUNIS HBV Genotype EIA, Институт иммунологии, Токио, Япония). Титр ДНК HBV определяли с помощью теста COBAS TaqMan HBV ver. 2,0 (Roche Diagnostics K.K., Токио, Япония) или анализа Amplicor HBV Monitor (Roche Diagnostics K.K.); Нижние пределы обнаружения этих анализов составили 2,1 и 2,6 log копий / мл, соответственно.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВГВ

Полную ДНК выделяли из 200 мкл сыворотки пациента, собранной в указанные моменты времени на фиг. 1 с использованием мини-набора QIAamp Blood Mini (Qiagen K.K., Токио, Япония). Весь геном HBV амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, как описано [14]. Усиленные фрагменты были секвенированы непосредственно с помощью автоматического секвенатора ДНК (3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA).

СТРОИТЕЛЬСТВО РЕКЛИКАЦИОННО-КОМПЕТЕНТНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КЛОНОВ

ПЦР-амплифицированные фрагменты вводили в систему EasyGraph pGEM-T (Promega, Madison, WI). По меньшей мере пять клонов каждого фрагмента секвенировали и определяли консенсусную последовательность. Используя полученные клоны в качестве матриц, два фрагмента материала (фрагмент 1, нуклеотид [нт] 970-3215 / 1-178 и фрагмент 2, nt 178-2186, количество нуклеотидов было отнесено от клона прототипа генотипа C [номер доступа AB246344 , Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB246344]) с консенсусными последовательностями для конструирования, сгенерированного с использованием метода ПЦР слияния. Репликационно-компетентные молекулы HBV с длиной генома в 1.38 были сконструированы путем лигирования двух фрагментов материала (рис.2). Предназначенные мутации были введены путем сайт-направленной ПЦР и фрагментарного обмена. Установленные молекулярные клоны были секвенированы и подтверждены, что они правильно построены.

IMG_0654.PNG

Рисунок 2.

Создание компетентного по репликации 1,38-кратного молекулярного клона длины генома HBV. Указывается схема сконструированного репликации компетентного 1,38-кратного генома HBV. Эта конструкция содержит 4,432 пар оснований генома HBV и охватывает все четыре открытые рамки считывания. На верхней панели показан домен RT и введенные аминокислотные мутации в каждом клоне. Нижняя панель показывает мутации аминокислот в области RT и соответствующий поверхностный ген. Сокращения: OR, вне региона поверхностного гена; AA, аминокислота; PreC / C, прекур / область ядра; X, X-ген HBV; P, ген полимеразы HBV; PreS / S, preS / S область; S, поверхностный ген HBV.

ТРАНСФЕРЦИЯ В КЛЕТКИ HepG2

Клетки HepG2 получали из Европейской коллекции культур клеток, прошедших аутентификацию (Salisbury, UK, https://www.phe-culturecollections.org.uk/collections/ecacc.aspx) и культивировали при 37 ° С в среде с 5% CO2 в Полная среда роста. Клетки HepG2 при слиянии 80% -90% в чашках размером 100 мм трансфицировали 2,5 мкг молекулярных клонов HBV с использованием реагента Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) в соответствии с инструкциями производителя. Спустя двадцать четыре часа после трансфекции клетки промывали и среду заменяли на свежую среду с реагентами или без них. Трансфецированные клетки собирали через 3 дня после трансфекции. Реагенты против HBV для ETV и TDF были приобретены у LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN) и Selleck Chemicals (Хьюстон, Техас), соответственно.
ИЗОЛЯЦИЯ ДНК ВЗАИМОСВЯЗАННОГО ЧАЩЕ-ЧАСТИЦЫ

Выделение ДНК ВГВ, связанной с внутриклеточными ядрами-частицами, осуществляли, как описано Günther et al. С некоторыми изменениями. [15] Вкратце, клетки суспендировали в 500 мкл буфера для лизиса (100 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,2% Nonidet P40) и ядра осаждали центрифугированием. Супернатант переносили и обрабатывали ДНКазой (RQ1 РНКазы без ДНКазы, Promega) и РНКазой (RNase A, Qiagen K.K.). Затем добавляли протеиназу К, 500 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, 5 М NaCl и 10% додецилсульфат натрия, и образцы инкубировали при 55 ° С в течение 1 часа. ДНК HBV затем выделяли экстракцией фенолом-хлороформом (1: 1) и осаждением 2-пропанолом.

ГИБРИДИЗАЦИЯ ЮЖНОГО БЛОКА ДНК ВГВ

Выделенную ДНК HBV, связанную с ядерной частицей, разделяли на 1,0% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (положительно заряженную, Roche Diagnostics, Penzberg, Germany). Перенесенную мембрану иммобилизуют с помощью ультрафиолетового сшивающего агента и гибридизуют меченым щелочной фосфатазой зонд полноразмерного фрагмента ДНК HBV (регистрационный номер AB246344, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB246344) Сгенерированный с помощью системы маркировки Allegos Gene Direct (DIG-High Prime DNA Labeling и Detection Starter Kit II, Roche Diagnostics). Хемилюминесцентное детектирование проводили с CDP-Star (DIG-High Prime DNA Labeling и Detection Starter Kit II) и анализировали с использованием анализатора изображений LAS4000 (Fuji Photo Film, Токио, Япония).
КОЛИЧЕСТВО ДНК ВГВ ПО РЕАЛЬНОМУ ВРЕМЕНИ ПЦР

Титр ДНК-HBV, связанной с ядром-частицей, также оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с помощью универсального набора TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Были описаны последовательности праймеров и зонда [16]. Амплификацию и детектирование проводили с помощью PCR-систем StepOnePlus реального времени (Applied Biosystems).

материалы и методы пациентов мы провели ретроспективный анализ 70 пациентов с chb (мужчина / женщины, 53/17, означает, возраст, 46.6 ± 8.9 лет), который получил etv лечения на seizankai kiyokawa больницы, Токио, Япония, с декабря 2006 может 2016. все пациенты были клинически диагностированы с хроническим гепатитом и были hbsag-положительных и вгв ДНК-положительные, по крайней мере 6 месяцев до начала лечения. ни были диагностированы с циррозом печени или ГЦК. все пациенты получил 0.5 МГ etv для более чем на 1 год, и не пациента получил другие НАН. в этом исследовании был одобрен комитеты по этике нашего учреждений (утверждения числа 246 из seizankai kiyokawa больницы и 377 от национального института инфекционных заболеваний), и письменного обоснованного согласия был получен от каждого пациента. из 70 пациентов с chb обрабатывают etv, четырех случаях оказались огнеупорный (таблицы 1). эти четыре субъектов были мужской, положительные для hbsag и hbeag, и, инфицированных вгв генотипа С. их возраста в диапазоне от 40 до 59 лет, и все были отрицательные для серологических маркеры гепатита C вирус и вирус иммунодефицита человека инфекций. профили 4 etv-огнеупорные пациенты следующим образом: случае (40-летний мужчина; на фиг. 1а): администрация etv (0.5 МГ в день) началось в августе 2007. сыворотки вгв ДНК стал обнаружить после 3 лет etv лечения но вновь появились после 3.3 лет лечения. вгв ДНК титр был 8.0 войти копий / ML в это время. увеличение дозы etv (1.0 МГ в день) не было эффективным. в этом случае был поставлен диагноз vbt случае. вгв выделяли из сыворотки образцы, собранных на два моментов времени, в начале лечения (время точки 1), а также на vbt (время точки 2) (рис. 1а). изолированные hbvs были им клонов а1 и а2, соответственно. весь геномах по изоляции hbvs были секвенированы, и вывел аминокислот в rt области были выровнены и по сравнению с генотипом C консенсуса последовательность (поддержки рис. s1). известно сопротивление мутации в НАН не был обнаружен в клон а1. тем не менее, сообщили Лам устойчивые мутации rtv173l / l180m / m204v появился в клон а2. случае B (43-летний мужчина; на фиг. 1б): администрация etv (0.5 МГ в день) началось в апреле 2007. сыворотки вгв ДНК обнаружить после 2.5 лет etv лечения и остался обнаружить до 6.8 лет от начала etv когда вгв ДНК вновь появились и достиг 8.3 войти копий / ML. в этом случае также был поставлен диагноз vbt случае. hbvs изолированных в начале лечения (время точки 1), а также на vbt (время точки 2) были секвенированы (рис. 1б). как и в hbvs изолированных в случае, без сопротивления мутации был обнаружен в клон в1. тем не менее, мутации rtn238h / l269i сопровождается Лам устойчивые мутации rtl180q / m204v появился в клон в2. случае C (59-летний мужчина; на фиг. 1с): администрация etv (0.5 МГ в день) началось в июне 2010. сыворотки вгв ДНК 9.1 войти копий / ML до лечения и снижение 5.0 войти копий / ML вскоре после начала etv, Однако, вгв ДНК оставался положительные 1,5 лет etv лечения. в этом случае было считать частичное вирусологические ответ случае. вгв изолированных из сыворотки образцов на несколько моментов времени (время пунктов 1-3 на рис. 1с) были секвенированы. из этих вгв клонов, вывел аминокислотных последовательностей в rt области были идентичны, но было несколько различия по сравнению с генотипом C консенсуса последовательности. случае D (53-летний мужчина; на фиг. 1г): администрация etv (0.5 МГ в день) началось в июне 2007. после 2 лет лечения с etv сыворотки вгв ДНК стал обнаружить. после 3 лет от начала etv лечения, вгв ДНК вдруг вспыхнул. это вспышки планом вгв ДНК переходных и снизилась до обнаружить уровень без дополнительной обработки. поэтому, в этом случае было определено как вспышка случае. вгв был изолированных на три моментов времени: начале лечения (время точки 1), вспышка точки (время точки 2), и утихла точки (время точки 3) (рис. 1г). вывел аминокислотных последовательностей в rt области были идентичны в клонов д1 и d3 и аминокислот замена v191i был обнаружен в клон д2. все четыре пациентов были лечения наивно и подтвердили лекарства соблюдения. рисунок 1. рисунок 1. открытый на рисунке зрителя клинических курсы 4 etv-огнеупорные пациентов (: случае с vbt, B: случае B с vbt, C: случае C с частичной вирусологические ответ, D: случае D с вспышка). в сыворотке вгв ДНК титры (твердых квадратов) и Альт уровней (открыть кругов) показаны. Нижний предел обнаружения из вгв ДНК указывается пунктирной линии. сыворотки образцы были собраны в то время точки указано открыть стрелки с цифры и последовательность инфицированными вгв были проанализированы. аббревиатура: Альт, аланин аминотрансфераза. табл.1 профили etv-огнеупорные случаях пациентов при случае B случае C случае D значения в начале etv лечения. пол мужской мужской мужской мужской agea (год) 40 43 59 53 Альта (iu / ML) 312 211 291 309 вгв генотипа C C C C hbeag положительные положительные положительные положительные ядро промоутер (НТ 1762/1764) мутант / мутант мутант / мутант диких / дикая мутант / мутант precore (НТ 1896) диких диких диких диких вгв ДНК * (вход копирования / ML) 7.6 8.6 9.1 8.7 вирусологические маркеры для вгв hbsag и hbeag были измерены хемилюминесцентный иммуноанализа используя коммерческой тесте комплект (Эбботт Японии Лтд, Токио, Япония). вгв генотипа определяется иммуноферментного анализа (immunis вгв генотипа ОВОС, институт иммунологии Лтд, Токио, Япония). вгв ДНК титр определяется cobas taqman вгв тест вер. 2.0 (Рош диагностика k.k., Токио, Япония) или amplicor вгв монитор анализа (Рош диагностика k.k.); Нижний пределы обнаружения этих тестов были 2.1 и 2.6 войти копий / ML, соответственно. последовательность анализ вгв всего ДНК изолированных от 200 μl больного в сыворотке, собранных на указанных моментов времени на рис. 1, используя qiaamp крови мини-комплект (qiagen k.k., Токио, Япония). весь геном вгв была усилена ПЦР с использованием праймеров, как описано. [14] усиливается фрагменты секвенированы прямо с автоматизированной ДНК секвенсор (3500 генетических анализатор; применяется биосистемах, способствовать город, ca). строительство репликации-компетентным молекулярной клонов ПЦР-усиливается фрагменты вставлен в pgem-T легко вектор системы (promega, Мэдисон, wi). по крайней мере пять клонов каждого фрагмент были секвенированы, и консенсуса последовательность определяется. используя получены клонов в качестве шаблоны, два материал фрагментов (фрагмент 1, нуклеотидных [НТ] 970-3215 / 1-178 и фрагмент 2, НТ 178-2186; количество нуклеотидов был называют с генотипом C прототип клон [присоединения количество ab246344, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ab246344]) с консенсуса последовательности для строительства генерируется используя слияния ПЦР техника. репликации-компетентным вгв молекул с 1.38 раза генома длина были построены на лигирования двух материал фрагментов (рис. 2). предназначенных мутаций появились на сайт, направленных ПЦР и фрагменты подкачки. установлено молекулярной клонов секвенированы и подтвердил, чтобы быть правильно построен. рис.2 рис.2 открыть на рисунке зрителя строительство репликации-компетентным 1.38 раза вгв генома длина молекулярной клон. схему построенного репликации-компетентным 1.38 раза вгв генома указано. это построить содержит 4,432 bp из вгв генома и охватывает все четыре открыть рамки считывания. верхней панели показывает области rt и введены аминокислот мутации в каждом клон. нижней панели указывает аминокислот мутации в rt регионе и соответствующие поверхности гена. сокращения: или, из области поверхности гена; aa, аминокислот; prec / C, precore / основные области; X, X ген вгв; P, полимеразы ген вгв; пре / s, пре / s регионе; s, поверхность ген вгв. трансфекции в hepg2 клеток hepg2 клетки, полученные от Европейского коллекция аутентифицирован клеток культур (Солсбери, Великобритания, https://www.phe-culturecollections.org.uk/collections/ecacc.aspx) и культурный при 37 ° C в 5% со2 окружающей среды в полный рост средней. hepg2 клеток 80% -90% слияния 100-мм блюда были трансфецированные 2,5 μg из вгв молекулярной клонов, используя lipofectamine 3000 реагента (Термо Фишер научных, waltham, Ма) в соответствии с инструкциями производителя. двадцать четыре часа после трансфекции, клетки промывают и среднего было изменено на свежие средней с или без реагентов. трансфецированные клетки были собраны на 3 дня после трансфекции. против гепатита реагенты etv и tdf были приобретены от lkt лабораторий, Инк (Сент-пол, mn) и Selleck химических веществ (Хьюстон, tx), соответственно. изоляции ядро-частиц, связанные вгв ДНК изоляции внутриклеточного ядро-частиц, связанные вгв ДНК было достигнуто, как описано в Гюнтер ET al. с некоторыми изменениями. [15] кратко, клетки были приостановлены 500 μl из лизиса буфера (100 мм трис-hcl ph 8.0, 0.2% nonidet p40), и ядер были pelleted центрифугированием. супернатант переданы и обрабатывают dnase (rq1 рнказа без dnase; promega) и рнказа (рнказа; qiagen k.k.). затем, протеиназой K, 500мм этилена диамин tetraacetic кислоты, 5 M nacl, и 10% додецилсульфат натрия были добавлены и образцы инкубировали 55 ° C в течение 1 часа. вгв ДНК затем выделяют фенола-хлороформа (1: 1) извлечение и 2-пропанол осадков. Южной блот гибридизации вгв ДНК изолированных ядро-частиц, связанные вгв ДНК, разделенных на 1,0% агарозном геле и переданы нейлон мембраны (положительно заряженных; Рош диагностика, penzberg, Германия). переданы мембраны был иммобилизованной от ультрафиолетового сшивающего агента и hybridized по alkaline- фосфатазы меченных зонд полнометражных вгв ДНК фрагмент (присоединения количество ab246344, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ab246344) создается с гена изображения alkphos прямой маркировки системы (копать высотой премьер-ДНК маркировки и обнаружения стартер комплект второй; Рош диагностика). хемилюминесцентный обнаружения проводили с cdp-звездочный (копать высотой премьер-ДНК маркировки и обнаружения стартер комплект второй) и анализировали с использованием las4000 изображение анализатор (Фудзи фото фильм, Токио, Япония). количественное вгв ДНК в режиме реального времени ПЦР титр ядро-частиц, связанные вгв ДНК также оценивается в режиме реального времени ПЦР с taqman быстро универсальный ПЦР-мастер смесь (применяются биосистемах, способствовать город, ca). последовательности грунтовки и зонда используется были описаны. [16] усиления и обнаружения проводились с steponeplus в режиме реального времени ПЦР систем (применяются биосистемах). расчет 50% эффективным концентрации значение и подходят модель дозе-ответ кривые обращается с использованием graphpad призму 6 программного обеспечения (graphpad программного обеспечения, Инк, Ла jolla, ca). эффективным концентрации необходимых для ингибирования 50% (ec50) значения были рассчитывается с данными, полученные в режиме реального времени ПЦР. следующую модель был использован привлечь доза-ответ кривой: Y = нижней + (топ - снизу) / (1 + 10∧ ((X - logec50))), где X является концентрация реагента, Y является ответ выражается как процент ядро-частиц, связанные вгв ДНК, связанных с соответствующей управления, logec50 представляет войти ec50 управления, и верхней и нижней представляют Y значения в верхней и нижней плато оборудованная кривой, соответственно. статистического анализа статистического анализа проводили с использованием неспаренными два хвостами студент T тест с Уэлч в коррекции. P значениями <0.05 считались статистически значительным. результаты строительство вгв молекулярной клонов, используя полный генома последовательность вгв изолированных в начале лечения в каждом случае мы построен репликации-компетентным 1.38 раза вгв генома длины молекулярной клонов. эти молекулярной клонов содержать 4,432 bp из вгв генома, охватывающих все четыре открыть рамки считывания (рис. 2). в тех случаях, B, и D, мутации, которые появились во время etv лечения были введены в прототип клон (клонов а1, в1, и д1) каждого случая и генерируется клонов а2, в2, и д2, соответственно (верхняя панель рис. 2, поддерживая рис. s1). некоторые из этих мутации в rt сопровождались аминокислот мутации перекрытия поверхности генов, как указано в нижней панели рис. 2. случае C, все изолированных клонов имеют одинаковые аминокислот в rt регионе, но некоторые различия по сравнению с генотипом C консенсуса последовательности. мы выбрали аминокислотные замена i122l / n123h обнаружен между rt домены B и С. мы введены эти мутации в пациента изолированных клон, клон C-pt, и генерируется клон C-wt. эти мутации не затрагивает аминокислот в поверхности гена.

ANALYSIS FOR SUSCEPTIBILITIES TO ETV

Using these generated HBV molecular clones, we assessed the replication efficiencies and susceptibilities to ETV in culture cells. Plasmids of HBV clones were transfected into HepG2 cells, and ETV was administered to the transfected cells at concentrations of 500, 50, 5, and 0.5 nM. After 3 days of treatment with ETV, the cells were harvested and intracellular core-particle-associated HBV DNA was extracted. The amounts of core-particle-associated HBV DNA were assessed by Southern blotting and real-time PCR. All patient-derived HBV molecules were replicable in HepG2 cells, and by administration of ETV, HBV replication was reduced in a dose-dependent manner (Fig. 3). These reductions of HBV replication were similarly observed by both Southern blotting and real-time PCR. To assess the susceptibility to ETV, the EC50 values were determined by drawing the dose-response curves with data obtained by real-time PCR (Fig. 4; Table 2).

IMG_0655.PNG

Рисунок 3

Replication of patient-derived HBV molecular clones and susceptibility to ETV (A: Case A with VBT, B: Case B with VBT, C: Case C with partial virological response, D: Case D with flare-up). HBV molecular clones were transfected into HepG2 cells, and ETV was administered to the transfected cells at the indicated concentrations. HBV replication and its reduction by ETV administration were assessed by measuring the intracellular core-particle-associated HBV DNA using Southern blotting (upper panel) and real-time PCR (lower panel). The results are shown as the means ± SD. Abbreviations: DSL, double-stranded liner HBV DNA; RC, relaxed circular HBV DNA; SS, single-stranded HBV DNA.

IMG_0656.PNG


Рисунок 4.

Открыть в программе просмотра рисунков
Анализ кривой зависимости доза-реакция восприимчивости клонов HBV, полученных от пациентов и идентифицированных мутацией (A: случай A с VBT, B: случай B с VBT, C: случай C с частичным вирусологическим ответом, D: случай D с обострением ). Кривые зависимости «доза-ответ» были взяты из данных, полученных в режиме ПЦР в реальном времени, описанных на рис. 3 и поддерживая Fig. S2. Количество связанного с ядром HBV ДНК без обработки ETV определяли как необработанный контроль, и рассчитывали процентное соотношение количества ДНК HBV, связанной с ядром, с указанной концентрацией ETV. Результаты показаны как среднее значение ± SD.

анализ для восприимчивостей к etv используя эти генерируется вгв молекулярной клонов, мы оценили репликации эффективности и восприимчивостей к etv в культуре клеток. плазмид из вгв клонов трансфецированные в hepg2 клеток, и etv вводили в трансфецированные клеток в концентрации 500, 50, 5, и 0.5 nm. после 3 дней лечения с etv, клетки были собраны и внутриклеточных ядро-частиц, связанные вгв ДНК экстрагировали. количество ядро-частиц, связанные вгв ДНК оценивали по Южной промокательной и в режиме реального времени ПЦР. все пациента, полученных вгв молекул воспроизводимые в hepg2 клеток, и от администрации etv, вгв репликации сократился в зависимости от дозы образом (рис. 3). эти сокращения вгв репликации были точно наблюдается обеими Южной промокательной и в режиме реального времени ПЦР. для оценки восприимчивость к etv, ec50 значения были определены рисунок доза-ответ кривые с данными, полученные в режиме реального времени ПЦР (рис. 4; таблице 2). рис.3 рис.3 открыть на рисунке зрителя репликации пациента, полученных вгв молекулярной клонов и восприимчивость к etv (: случае с vbt, B: случае B с vbt, C: случае C с частичной вирусологические ответ, D: случае D с вспышка). вгв молекулярной клонов трансфецированные в hepg2 клеток, и etv вводили в трансфецированные клеток в указанных концентрации. вгв репликации и ее снижение по etv администрации были оценены измерения внутриклеточных ядро-частиц, связанные вгв ДНК, используя Южной промокательной (верхняя панель) и в режиме реального времени ПЦР (нижняя панель). результаты представлены в качестве средства ± SD. сокращения: dsl, двутяжной лайнер вгв ДНК; rc, спокойной круговой вгв ДНК; ss, однонитевой вгв ДНК. рис.4 рис.4 открыть на рисунке зрителя доза-ответ кривой анализ восприимчивостей пациента происхождения и определены мутации-введены вгв клонов (: случае с vbt, B: случае B с vbt, C: случае C с частичной вирусологические ответ, D: случае D с вспышка). доза-ответ кривые обращается с данными, полученные в режиме реального времени ПЦР описано на рис. 3 и поддержки рис. с2. количество ядро-частиц, связанные вгв ДНК без etv лечение определяется как лечить управления, а в процентах от суммы основного-частиц, связанные вгв ДНК в указанных концентрация etv были рассчитаны. результаты представлены в качестве средства ± SD. Таблица 2. репликации эффективности и ec50 значения для etv из вгв клонов репликации эффективности etv сопротивление клонов вгв ДНК (копировать / ML) раз ec50 в nm (95% ci) раз сопротивление P <0.05 по сравнению с прототипом каждого клон. клон а1 8.06 х 107 ± 5.06 х 106 1 0.0865 (0.0533-0.141) 1 клон а2 3.98 х 107 ± 2.32 х 106a 0.494 8.60 (5.68-13.0) 99.3 клон а1 + mv 5.24 х 106 ± 2.78 х 105a 0.0651 9.95 (7.39-13.4) 115 клон в1 1.80 х 107 ± 1.10 х 106 1 0.135 (0.0999-0.182) 1 клон в2 4.44 х 106 ± 3.89 х 105a 0.247 8.63 (3.26-22.8) 63.9 клон в1 + qv 1.22 х 106 ± 1.14 х 105a 0.0675 0.530 (0.244-1.15) 3.92 клон в1 + qvh 8.37 х 105 ± 3.17 х 104a 0.0465 0.670 (0.286-1.57) 4.96 клон в1 + qvi 1.54 х 106 ± 1.15 х 105a 0.0855 11.4 (4.30-30.4) 84.6 клон C-pt 5.86 х 106 ± 1.93 х 105 1 0.271 (0.153-0.480) 1 клон C-wt 5.88 х 106 ± 5.40 х 105 1.00 0.215 (0.132-0.350) 0.794 клон д1 4.84 х 105 ± 4.74 х 104 1 0.377 (0.257-0.552) 1 клон д2 9.37 х 105 ± 5.83 х 104a 1.94 0.454 (0.351-0.587) 1.21 в оценках вгв клонов изолированных от пациентов и B, вгв ДНК титры без etv лечения были значительно ниже (P <0.05) в клонов а2 и в2 по сравнению с прототипом клонов а1 и в1 (0.494 раза и 0.247 раза, соответственно), предполагая, Нижний репликации эффективность появились клонов во время etv лечения (Таблица 2). мутацию-введены клонов а2 и в2 выставлены значительно ниже, восприимчивость к etv по сравнению с прототипом клонов (клонов а1 и в1). рассчитывается ec50 значения клонов а2 и в2 были 99.3 раза и 63.9 раза выше, чем у клонов а1 и в1, соответственно. в оценках вгв клонов изолированных от пациента, C, вгв ДНК титры клон C-pt без etv лечения были похожи на клон C-wt. тем не менее, в оценках вгв клонов изолированных от пациента, D, вгв ДНК титры клон д2 без etv лечения были значительно выше, (1.94 раза), чем у клон д1. ec50 значения клон C-pt и д2 были сопоставимы с тех клонов C-wt и д1, соответственно. идентификации ответственного мутации etv сопротивления в нашей оценке с пациентом происхождения вгв молекулярной клонов, клонов а2 и в2 выявлены быть устойчивым к etv. оба клонов есть ключ Лам устойчивые мутации плюс один или два дополнительных мутации (рис. 2). для выявления мутация ответственны за etv сопротивления, мы провели отображение исследование генерации дополнительные клонов следующим образом: клон а2 имеет мутации rtv173l с ключом Лам устойчивые мутации rtl180m / m204v. мы генерируется клон, что имеет только Лам устойчивые мутации rtl180m / m204v и назван клон а1 + mv. клон в2 имеет мутации rtn238h / l269i сопровождается Лам устойчивые мутации rtl180q / m204v. таким образом, мы генерируется три клонов следующим образом: клон в1 + qv (введен только Лам устойчивые мутации rtl180q / m204v клонировать а1), клон в1 + qvh (введен rtl180q / m204v плюс rtn238h клонировать а1), и клон в1 + qvi (введен rtl180q / m204v плюс rtl269i клонировать а1).

Используя эти дополнительные клоны, мы сравнили эффективность репликации и восприимчивости к ETV с прототипом каждого клона (фиг.4). По сравнению с клоном A1, клон A1 + MV проявил резистентность к ETV. Величина EC50 клона A1 + MV была в 115 раз выше, чем у клона A1, и была сравнима с клоном A2 (таблица 2). С другой стороны, эффективность репликации клона A1 + MV была существенно ниже. Титр ДНК HBV клона A1 + MV без обработки ETV был в 0,0651 раза ниже, чем у клона A1. Эти данные показывают, что введение дополнительной мутации rtV173L спасло эффективность репликации до 0.494-кратного количества клона A1. В случае клона В клон с LAM-устойчивыми мутациями rtL180Q / M204V (клон B1 + QV) проявляет слегка уменьшенную восприимчивость к ETV. Величина EC50 этого клона была в 3,92 раза выше, чем у клона B1. Добавление к этому клону rtN238H (клон B1 + QVH) не улучшало сопротивление ETV. Однако добавление мутации rtL269I (клон B1 + QVI) приводило к серьезному ухудшению восприимчивости ETV. Величина EC50 клона B1 + QVI была в 84,6 раза выше, чем у клона B1 и сравнима с клоном B2. Уровни репликации клонов B1 + QV, B1 + QVH и B1 + QVI были почти идентичны; Однако, когда эти мутации были объединены (клон B2), эффективность репликации была увеличена до 0,247-кратного количества клона B1. Мы также проанализировали влияние только мутации rtL269I. Величина EC50 клона B1 + I составляла 0,472 нМ (95% доверительный интервал [CI], 0,318-0,699) и была в 3,50 раза выше, чем у клона B1.

АНАЛИЗ ВОСПРИИМЧИВОЙ КЛОНЫ

Для оценки восприимчивости к TDF этих устойчивых к ETV клонов, клоны трансфецировали в клетки HepG2 и обрабатывали TDF в концентрациях 500, 50, 5 и 0,5 нМ. Репликация этих клонов HBV аналогичным образом ингибировалась путем обработки TDF дозозависимым образом (фиг.5). Величины EC50 клонов A1 и A2 составляли 10,5 нМ (95% ДИ, 6,65-16,6) и 10,7 нМ (95% ДИ, 6,41-17,8) соответственно. Величины EC50 клонов B1 и B2 составляли 11,4 нМ (95% CI, 5,45-23,9) и 10,5 нМ (95% CI, 3,46-32,1) соответственно. Эти данные показывают, что устойчивые к ETV мутации, идентифицированные в этом исследовании, не обладают резистентностью к TDF.

IMG_0657.PNG


Рисунок 5.

Открыть в программе просмотра рисунков
Восприимчивость к TDF устойчивых к ETV клонов, идентифицированных в этом исследовании. Молекулярные клоны HBV, полученные от пациентов A и B, трансфицировали в клетки HepG2, и TDF вводили в трансфецированные клетки в указанных концентрациях. (A, B) репликации HBV и ее уменьшении при введении TDF оценивали путем измерения ДНК HBV, связанной с внутриклеточными ядрами и частицами, с использованием ПЦР в реальном времени. (C, D) На основании полученных данных были построены кривые зависимости «доза-ответ». Количество связанного с ядром HBV ДНК без обработки TDF определяли как необработанный контроль и рассчитывали процентное соотношение количества ДНК HBV, связанной с ядром, с указанной концентрацией TDF. Результаты показаны как среднее значение ± SD.


обсуждение

HBV является значительным человеческим патогеном, который распространяется во всем мире. Примерно 240 миллионов человек в мире заражены CHB [4]. Хотя в терапии анти-ВГВ с помощью НС были достигнуты успехи, пациентам, инфицированным этим вирусом, все еще требуется многолетнее лечение или пожизненное лечение [17]. Даже при лечении с помощью ЭТВ требуется один из самых мощных реагентов против HBV с очень низкой устойчивостью, требуется долгосрочное введение этого реагента, что часто приводит к появлению резистентных вариантов, связанных с резистентностью. Поэтому анализ связанных с резистентностью вариантов в таких случаях незаменим. В этом исследовании для оценки устойчивых к ETV мутаций мы генерировали репликационно-компетентные молекулярные клоны HBV с использованием последовательностей из четырех случаев рефрактерности ETV и оценивали устойчивость к NAs, ETV и TDF после временной трансфекции в клетки HepG2. Мы оценили способности к репликации и восприимчивость этих клонов с помощью Саузерн-блоттинга и обнаружили, что их можно количественно оценить с помощью ПЦР в реальном времени для ДНК-HBV, связанной с ядром-частицей. Мы использовали молекулярный клон длиной в 1.38 раза с геномом, который содержит две копии Х-области (рис.2) и, следовательно, имеет некоторые преимущества в эффективности репликации по сравнению с молекулярными клонами минимальной длины [18]. Мы считали предпочтительным получение достаточной эффективности репликации молекулярных клонов HBV с последовательностями, полученными от пациентов. Среди четырех случаев резистентности к ETV мы обнаружили варианты устойчивости к ETV у двух пациентов с VBT (случаи A и B). Клоны HBV, выделенные из других случаев, проявляли восприимчивость к ETV.
ETV-устойчивые варианты были обнаружены в случаях VBT, и ответственные мутации были идентифицированы в обоих клонах. В случае A возникший HBV у VBT (клон A2) имел три мутации по сравнению с прототипом клона A1, который был выделен в начале лечения. Известно, что идентифицированные мутации, rtV173L / L180M / M204V, устойчивы к LAM. [19] Среди них rtL180M / M204V сообщалось ранее, чтобы обеспечить устойчивость LAM, связанную со снижением эффективности репликации. [20] Мутация rtV173L не влияет на восприимчивость к LAM, но вместо этого усиливает репликацию вируса. [19] Точно так же введение мутаций rtL180M / M204V в клоне A1 может обеспечить устойчивость к ETV. Величина EC50 клона с этими мутациями была в 99,3 раза выше, чем у клона прототипа, и на нее не влияло введение дополнительной мутации rtV173L. С другой стороны, эффективность репликации была сильно уменьшена мутациями rtL180M / M204V, но была спасена rtV173L. Эти наблюдения за компенсацией rtV173L были аналогичны случаю сопротивления LAM [19], и мы могли уточнить, что эти мутации также связаны с сопротивлением ETV. ETV-устойчивый уровень клона A1 + MV, по-видимому, был высоким, хотя существенная роль устойчивых к LAM мутаций в ETV хорошо известна. Более того, связанная с RTL180M / M204V высокая устойчивость к ETV была зарегистрирована в штаммах, полученных от пациентов, но не в лабораторных штаммах [21] Такое высокоуровневое ETV-сопротивление, связанное с этими мутациями, может быть свойственно клону EFT-рефрактерного пациента, и другие аминокислотные остатки в области RT или других регионах могут быть связаны с этой резистентностью к ETV. Эти данные свидетельствуют о том, что переход на добавление ETV к пациентам, не получавшим лечение LAM, описанным в отчетах, не рекомендуется [22, 23]
В случае B клон B2 с четырьмя мутациями rtL180Q / M204V / N238H / L269I появился во время обработки ETV. Картографическое исследование этих мутаций показало, что ключевые резистентные к LAM мутации rtL180Q / M204V могут придавать устойчивость к ETV, аналогичную HBV, выделенной в случае A, но степень резистентности не была высокой. Значение EC50 было в 3,92 раза выше, чем у прототипа клона. Этот более низкий вклад этих мутаций в резистентность к ETV можно объяснить различием мутаций при rt180; M или Q, или к генетическому фону штаммов в других регионах. Путем добавления rtL269I для клонирования B1 + QV, ETV-сопротивление было увеличено и EC50 был увеличен до уровня, подобного клонов B2, хотя добавление мутации rtN238H оказывает минимальное влияние на устойчивость ETV. Мутация rtN238H иногда обнаруживалась у пациентов, получавших NA, и сообщалось, что она не влияла на восприимчивость к LAM, ADV или другим NA. [24-26] Мутация rtL269I также была обнаружена у пациентов, не получавших лечение. Сообщается, что эта мутация повышает эффективность репликации и ассоциируется с повышенной эффективностью репликации в сочетании с мутацией rtM204I, хотя сам rtL269I не изменяет восприимчивость к NA. [25, 27] В нашем эксперименте rtL269I, но не rtN238H, может усиливать Сопротивление ETV в сочетании с rtL180Q / M204V, что согласуется с предыдущими данными [27, 28]
В этом исследовании мы обнаружили два устойчивых к ETV варианта, клоны А2 и В2. Клон A2 включал LAM-устойчивые мутации, а клон B2 - новые устойчивые к ETV мутации. Оба клона были выделены при VBT и имели 99,3-кратное и 63,9-кратное сопротивление, соответственно, по сравнению с прототипом. В таких клинических ситуациях потребуется отбор и применение других соответствующих НС. Мы оценили восприимчивость к TDF этих устойчивых к ETV вариантов и обнаружили, что репликация этих вариантов эффективно подавляется. Значения EC50 были аналогичны значениям протонов-клонов. В самом деле, пациентку случая В обрабатывали 300 мг TDF ежедневно после VBT и достигали достаточного снижения уровней HBV ДНК и HBsAg (данные не показаны). Таким образом, система репликации HBV будет полезна для определения эффективных реагентов для случаев отказа от лечения.
обсуждение вгв является значительным человека возбудителя, что является распространение по всему миру. около 240 миллионов людей во всем мире есть chb инфекции. [4] хотя успехи были сделаны в борьбе с вгв терапии с НАН, пациенты, инфицированных этот вирус еще нужно много лет лечения или в течение всей жизни лечения. [17], даже в лечение с etv, одним из наиболее мощным анти-вгв реагенты с очень низким сопротивлением скоростью, долгосрочные администрации этого реагента требуется, и это часто приводит к появлению сопротивления, связанные варианты в огнеупорные случаях. поэтому, анализ сопротивления, связанные варианты в таких случаях является обязательным. в этом исследовании, до оценивать etv устойчивостью мутации, мы генерируется репликации-компетентным вгв молекулярной клонов, используя последовательности из четырех etv-огнеупорные случаях и оценены сопротивление НАН, etv, и tdf после переходных трансфекции в hepg2 клеток. мы оценили репликации способностей и восприимчивостей этих клонов по Южной промокательной и обнаружили, что они могут быть количественно путем в режиме реального времени ПЦР для ядра-частиц, связанные вгв ДНК. мы использовали 1.38 раз-генома длина молекулярной клон, который содержит две копии X регионе (рис. 2) и, следовательно, есть некоторые преимущества в репликации эффективности по сравнению с минимальной длины молекулярной клонов. [18] мы считали предпочтительно, чтобы получить достаточно репликации эффективность вгв молекулярной клонов с пациентом происхождения последовательности. среди четыре etv-огнеупорные случаях мы обнаружили etv устойчивостью варианты в двух vbt пациентов (случаях и B). вгв клонов изолированных от других случаях выставлены восприимчивостей к etv. etv устойчивостью варианты были обнаружены в vbt случаях и ответственность мутации были определены в обоих клонов. в случае, появились вгв на vbt (клон а2) было три мутаций, по сравнению с прототипом клон а1, которые выделяют в начале лечения. определены мутации, rtv173l / l180m / m204v, как известно, быть Лам устойчивые. [19], среди них rtl180m / m204v были сообщалось ранее, чтобы придать Лам сопротивления, связанные с падением репликации эффективности. [20] rtv173l мутации не затрагивает восприимчивость к Лам но вместо расширенные репликации вируса. [19] аналогично, введение rtl180m / m204v мутации в клон а1 может придать etv сопротивления. ec50 значение клон с этих мутации был 99.3 раза выше, чем у прототип клон и не было затронуты введение дополнительных мутация rtv173l. с другой стороны, репликации эффективности был сильно уменьшается на мутации rtl180m / m204v но спасает rtv173l. эти наблюдения компенсации rtv173l были аналогичные с случае Лам сопротивления, [19], и мы могли уточнить, что эти мутации, также, связанные с etv сопротивления. etv устойчивостью уровень клон а1 + mv, казалось, чтобы быть высокой, несмотря на то необходимо роль Лам устойчивые мутации в etv известно. более того, rtl180m / m204v связанных высокого уровня сопротивления etv был сообщили в пациента, полученных штаммов, но не лаборатория штаммов. [21], таких высокого уровня etv сопротивления, относящаяся к этим мутации может быть, свойственных etv огнеупорные пациента, полученных клон, и другие аминокислотных остатков в rt регионе или других областях может быть, связанные с этим etv сопротивления. эти данные свидетельствуют о том, что переключиться на или добавить-на из etv к Лам лечения отказа пациентов описано в отчеты был не рекомендуется. [22, 23] в случае, B, клон в2 с четырех мутации rtl180q / m204v / n238h / l269i появились во время etv лечения. отображение изучение этих мутации показал, что основные Лам устойчивые мутации rtl180q / m204v может придать etv сопротивления, подобно вгв изолированных в случае, но степени сопротивление не был высоким. ec50 значение был 3.92 раза выше, чем у прототип клона. этого нижнюю вклад этих мутации в etv сопротивление могут быть отнесены к разности мутации в rt180; M или q, или к генетическим фоны штаммов в других регионах. путем добавления rtl269i клонировать в1 + qv, etv сопротивления расширенные и ec50 увеличилась до уровня аналогичные клонировать в2, хотя и добавлением rtn238h мутацией было минимальным эффекты на etv сопротивления. rtn238h мутацией иногда обнаружен в на-пациентов и уже сообщалось, чтобы не влияют на восприимчивостей к Лам, расширенный, или других НАН. [24-26] rtl269i мутации также был обнаружен в на лечение отказа пациентам. в этом мутации было сообщено повышения репликации эффективности и быть связаны с повышенной репликации эффективности, когда в сочетании с rtm204i мутации, хотя rtl269i только не изменяют восприимчивостей к НАН. [25, 27] в нашем эксперимент, rtl269i, но не rtn238h может повысить etv сопротивления, когда в сочетании с rtl180q / m204v, который в соответствии с предыдущим данные. [27, 28] в этом исследовании мы обнаружены два etv устойчивостью варианты, клонов а2 и в2. клон а2 состоит Лам устойчивые мутации, и клон в2 harbored Роман etv устойчивостью мутации. оба клонов изолированных на vbt и выставлена 99.3 раза и 63.9 раза сопротивления, соответственно, по сравнению с прототипа. в таких клинической ситуации, выбор и администрации других соответствующих НАН должны будут. мы оценили восприимчивостей к tdf этих etv устойчивостью варианты и обнаружили, что репликации этих вариантов был эффективно подавляется. ec50 значения были аналогичные прототип клонов. на самом деле, больной корпуса B обращались 300 МГ tdf ежедневно после vbt и выполнено бонус к достаточно сокращение вгв ДНК и hbsag уровней (данные не показано). таким образом, вгв репликации система будет полезно для определения эффективным реагенты для лечения отказа случаях. с другой стороны, мы не определения etv устойчивостью варианты в тех случаях частных вирусологические ответ (случае C) и вспышки вверх (случае D). мы обнаружили, что вгв напряжения в случае C был постоянным. мы выбрали аминокислотные замен по сравнению с генотипом C консенсуса последовательность и оценены эффекты на восприимчивость к etv введением эти мутации. тем не менее, не замечательные разница в репликации эффективности или восприимчивости был обнаружен. таким образом, в этом случае других факторов для сопротивления, таких как хозяин факторы, связанные с противовирусные ответов, были значительно. генома всей ассоциации исследования показали, что генетических варианты, в человека лейкоцитов антигена (hla) -dp и hla-dq связаны с риском стойких инфекции вгв. [29, 30] полиморфизмы в hla-dp были также сообщил, чтобы быть связаны с оформление вгв по Лам лечения. [31], таких генетические изменения могут быть связаны с частичной вирусологические ответ на etv администрации наблюдается в случае, C, несмотря на эти изменения не были исследованы. мы обнаружен один аминокислот мутации, v191i, в rt области вгв изолированных на время точка вспышки в случае, Д. в нашем в пробирке оценки с этим мутации-введены клон, мы не смогли обнаружить любой воздействия на восприимчивость к etv. rta181t мутации связанных расширенный сопротивление имеет сообщалось. [28, 32-34] в этом мутации часто, связанные с остановить кодона на перекрывающихся поверхности гена, и sw172stop мутации ухудшает hbsag секрецию генерации усеченная белка, а также вызывает восприимчивость к расширенный ухудшаться. rtv191i мутации также, связанные с остановить кодоном поверхности генов (sw182stop), но ее влияние на etv сопротивление не было подтверждено. вместо этого, мы обнаружили, что это мутации повлияли на репликации эффективности. введение этого мутации в прототип клон расширенные репликации 1.94 раза. это расширение репликации могут быть связаны с вгв ДНК-титр вспышки в этом случае. это мутации также обнаружены в расширенный устойчивостью случаях, [35, 36], хотя в пробирке анализ показал, что это мутации, не связанные с расширенный сопротивления. в этом исследовании, до оценивать сопротивление НАН, мы использовали репликации-компетентным вгв молекулярной клонов. полный генома последовательность инфицированными гепатита в каждый пациент был определен и эксплуатации, чтобы сделать молекулярной клонов. с помощью этой стратегии, мы обнаружили, что вклад мутации в etv сопротивления клон зависит. введение аналогичных мутации в должности 180 и 204 в rt региона в а1 и в1 клонов привело в разные уровни сопротивления. поэтому, использование пациента, полученных вгв клонов важно, чтобы определить, правильное уровень сопротивления зараженных вгв у пациентов. в заключение, используя вгв репликации модель с пациентом происхождения последовательности, мы определили etv устойчивостью мутации. система используется в этом исследовании полезно для оценки репликации эффективности подверженности анти-вгв реагенты, и ответственный сопротивления мутации. такие оценки могут обеспечить стоит информации при выборе соответствующего лечения стратегии для лечения отказа случаях chb.

Вернуться в «Новости»

Кто сейчас на форуме (по активности за 5 минут)

Сейчас этот раздел просматривают: 1 гость